1. TINs in the mammary TME demonstrate potent immunosuppression
2. scRNA-seq reveals distinct transcriptomes between TINs and blood neutrophils
作者发现三种乳腺癌模型中中性粒细胞都增多(a-b)。随后作者取了小鼠模型的血和肿瘤组织，分选中性粒后进行了单细胞测序，得到了外周血中性粒BNs和肿瘤浸润中性粒TINs (c-d)。与BNs相比，TINs中IL-6, p38 MAPK, MIF regulation of innate immunity, NRF2介导的氧化应激反应等通路显著激活(e)。差异基因结果显示与BNs相比，TINs中多种趋化因子，促炎因子出现显著上调，Acod1也显著上调 (f-g)。只展示代谢相关基因发现一些代谢酶如Ptgs2也出现显著上调(h)。
To identify metabolism-related gene expression changes, KEGG-cataloged metabolic enzyme genes with expression reads in BNs and TINs were analyzed. (h图可以参考)
3. Acod1 is highly expressed in TINs of primary and metastatic BC in mice and patients
与E0771-bearing mice 或 tumor-free lung相比，乳腺癌中性粒升高，且在肺转移的中性粒中更高(a)。且在三种模型中，乳腺癌中性粒及肺转移中性粒中Acod1都显著比骨髓血液和脾脏更高(b)。乳腺癌组织的免疫荧光结果显示Acod1只在髓系细胞表达，且在TIN中最高(c-e)。而在E0771-colonized lung，超过80%的Ly6G阳性细胞表达Acod1 (f-g)。随后作者在患者组织上进行了验证 (h-i)。
在已发表的人的肿瘤单细胞测序数据中，作者同样发现Acod1在乳腺癌肿瘤髓系细胞中高表达，在中性粒细胞中更高，而在血中不表达。
4. Neutrophil Acod1 promotes lung metastasis in mouse BC models
为了探究Acod1的功能，作者使用E0771 genetically labeled with mcherry or TR (tk-GFP-luciferase triple reporter) 来评估WT和Acod1-/-小鼠中primary tumors 和 lung metastasis情况(a)。作者发现lung metastasis burden在Acod1-/-鼠显著更低(b,c)，死亡率也更低(d)。随后作者给造模小鼠注射了pbs或dimethyl itaconate (DMI) (e)，发现DMI在不影响原发肿瘤生长的情况下促进肿瘤转移，降低存活率(f-h)。
随后作者进行了neutrophil adoptive cell transfer (ACT)。作者分选了WT 和 Acod1-/-小鼠的骨髓细胞，与E0771条件培养基一起培养了3天，随后进行了中性粒分选。结果发现WT 而不是 Acod1-/-小鼠的BMDNs可以诱导Acod1的表达(j)。随后作者将分选的BMDNs回输给小鼠(i)。与回输了CM-induced WT BMDNs小鼠相比，接受了CM-induced Acod1-/- BMDNs的小鼠肺转移更少(k,l)，存活更长(m)。在MMTV-PyMT Acod1+/+ 和MMTV-PyMT Acod1-/-小鼠(n-o)和中性粒特敲鼠中(p,q)也得到了一致的结果。. ICB-treated Mrp8-cre+ Acod1f/f 鼠的存活时间也显著长于于 ICB-treated Acod1f/f littermates (g)。当 使用Fer-1或vehicle治疗ICB-treated Mrp8-cre+
Acod1f/f 鼠时，Fer-1 显著促进了 metastasis-bearing mice的死亡(h)。
5. Tumor-secreted GM-CSF induces Acod1 in neutrophils through the STAT5-C/EBPb axis
接着比较常规的做了上游
6. Acod1 sustains TIN survival by blunting ferroptosis
此前有文献报道肺转移肿瘤中的中性粒的ROS升高。且在巨噬细胞和肝细胞中，Acod1可以下调ROS和氧化应激。为了探究TIN中Acod1是否可以下调ROS，作者分离了定量了WT 或 Acod1-/-小鼠的E0771肺转移组织的TINs ，并检测了细胞ROS，脂质ROS和线粒体ROS。发现缺乏Acod1的TIN三种ROS都升高(a-c)。由于ROS对中性粒细胞的死亡至关重要，作者检测了TIN的死亡情况，发现Acod1-/-小鼠TIN减少，活性也下降(d-f)。
Ferroptosis is iron-dependent cell death triggered by excessive ROS burden and lipid peroxidation. 由于Acod1-deficient
TINs的ROS升高，活性下降，作者推测Acod1 的loss 使得 TINs 对铁死亡更敏感。所以作者使用铁死亡抑制剂ferrostatin-1 (Fer-1)干预WT 和 Acod1-/- 荷瘤小鼠，发现给予Fer-1的Acod1-/- 荷瘤小鼠肺转移加重，TIN增加(g-h)。体外实验中，作者提取了WT或 Acod1-/-小鼠的骨髓细胞，在GM-CSF条件下与肿瘤细胞共培养。并在其中加入Fer-1和4-OI (i)，发现在Acod1-/- BMDNsTES 可以诱导更加显著的lipid peroxidation and viability loss。而这种现象可以被4OI或Fer-1所消除(j-l)。
Taken together, we conclude that Acod1 overexpression protects TINs from ferroptosis, allowing more accumulation of TINs in the metastatic TME.
7. Acod1 blunts TIN ferroptosis through activating Nrf2-mediated antioxidant response
接着作者给Acod1找了一个已知的下游nrf2（Itaconate is an anti-inflammatory metabolite that activates Nrf2 via alkylation of KEAP1）。
作者发现Acod1敲除后，Nrf2蛋白显著下降(a)，mRNA没有显著变化(b)。Acod1敲除的TIN中，抗氧化基因Gpx4, Gclc, 和 Nqo1也显著下降(c)。而Nrf2的抑制剂ML385则抵消了对照和Acod1敲除细胞的差异(c)。ML382处理后lipid peroxidation升高，cell viablity下降(d-f)。相反，Nrf2的激活剂NK252降低了TES-treated Acod1-/- BMDNs 的lipid peroxidation，升高了cell viability，消除了WT and Acod1-/- BMDNs的差异(g-i)。最后作者检测了Acod1敲除对glutathione (the primary antioxidant metabolite antagonizing ferroptosis)的影响。WT BMDNs比Acod1-/- BMDNs的glutathione更高，而4-OI或DMI可以显著升高两种BMDN的glutathione(j,k)。
Together, these data elucidate that itaconate
produced by Acod1 attenuates TIN ferroptosis by stimulating the Nrf2 antioxidant pathway.
8. Acod1 extinction boosts adaptive immunity and enhances immunotherapy
作者发现Acod1的metastasis-constraining effect是依赖于适应性免疫，因为Rag1-/- Acod1+/+ 和 Rag1-/- Acod1-/-小鼠出现了类似的E0771-TR lung metastasis burden 和生存时间(a-c)。此外，Acod1-/- host 在使用 ICB（aPD1 plus aCTLA4）治疗后生存时间显著延长(d)。Acod1
depletion 和 ICB组的TIN显著下降(e)，CD8T和CD4T显著增加，Treg下降，CD8T表达IFNG和GZMB也上升(f)。
这篇文章吧，用的模型鼠好多，临床意义也比较大，整体做的蛮不错的。但是感觉效应做的效应很多都是间接效应，算是一点点小不足吧。