RNA酶是导致RNA降解最主要的物质,广泛存在且稳定,可耐受多种处理(如煮 沸、高压灭菌等)而不被灭活。RNA酶催化的反应一般不需要辅助因子,因而RNA制剂中只要 存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,进而直接影响RNA分析结果。 在所有RNA实验中,核糖核酸酶(RNA酶)的污染是导致实验失败的最主要原因。因此,在RNA 的制备与分析操作实验中,要严格防止RNA酶的污染。在RNA提取实验前对器材及试剂的处 理非常的关键。焦碳酸二乙酯(DEPC) 是一种强烈的RNA酶抑制剂,其通过和RNA酶的活性 基团组氨酸的咪唑环结合使RNA酶变性,从而抑制RNA酶的活性。
(1)溶液处理:RNA制备过程中使用的所有溶液(包括水及其他盐溶液),须用0.1%DEPC (每100ml待处理溶液中加入0.1ml DEPC),在37℃处理12小时以上。然后用高压灭菌除去残留 的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过 滤除菌。处理后的溶液要单独存放。
(2)塑料器皿的处理:所有的塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗。离心管,枪 头等塑料器皿在经0.1%DEPC处理时,在37℃处理12小时以上,高压灭菌(尽量使用一次性无菌 塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品,如没有开封使用过,通常不必再处理)。
(3)玻璃器皿的处理:所有的玻璃器皿均应在使用前于200℃以上高温下烘烤至少6小时。
(4)有机玻璃的电泳槽等处理:先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H₂O₂中,室温10分钟,然后用0.1%DEPC水冲洗,晾干。